近年来，在生物医学领域，细胞和基因治疗（Cell & Gene Therapy, CGT）取得了显著的进展。例如，以anti-CD19和BCMA为标志的多种CAR-T免疫细胞疗法在治疗血液肿瘤方面展现出了良好的效果，同时，基于AAV载体的基因疗法也为罕见病患者带来了新的希望。随着CRISPR基因编辑技术的发展，基因治疗迎来了新的时代，体外基因编辑疗法CTX001即将上市，体内基因编辑疗法也显示了良好的临床结果。不过，CRISPR技术的安全性问题引起了广泛关注。由于其直接针对基因组DNA，任何不准确的改动都可能带来长期风险。因此，FDA等监管机构针对基因治疗安全性制定了相应的指导原则，主要关注两个方面：一是对基因组完整性的评估，确保不存在染色体重排、大片段插入或缺失、外来DNA整合及其潜在致癌性；二是识别脱靶编辑活动，包括其类型、频率和具体位置。

在这篇文章中，我们将主要介绍各种脱靶检测技术。脱靶效应（Off-target effect）是指在基因编辑过程中，CRISPR-Cas9等工具除了对目标序列进行编辑外，也可能错误作用于与目标序列相似的非目标位点，导致不期望的基因组改变。为了确保基因编辑的安全性和有效性，已经开发出多种方法来检测和评估脱靶效应。这些方法根据实验条件可以分为体内检测和体外检测两大类。

体内检测方法

体内检测方法是在活细胞或生物体内评估脱靶效应，这些方法通常可以更真实地反映生物学环境。

GUIDE-seq

GUIDE-Seq（Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing）是一种具有强大功能的脱靶效应检测工具。其基本原理是向细胞内引入双链寡核苷酸标记物（dsODN），该标记物能够插入由Cas9产生的DNA双链断裂位点。随后，利用高通量测序技术识别这些标记位点，从而全面发现潜在的脱靶位置。自推出以来，GUIDE-Seq因其高效性和准确性迅速成为评估基因编辑特异性的标准方法之一。

优点

• 提供全基因组水平的脱靶位点信息。
• 可直接检测体内的双链断裂事件，而非仅依赖靠预测或体外模拟。
• 能够检测低频的脱靶事件。

缺点

• 实验操作复杂，对技术水平有较高要求。
• 可能错过不易被标记物插入的脱靶位点，特别是在某些难以转染的细胞类型中实施难度较大。

应用场景

• 基因治疗安全性评估：确保CRISPR编辑的精准性，降低临床治疗中的脱靶风险。
• CRISPR工具优化：筛选高特异性的sgRNA或改进Cas9的变体。
• 基础研究：探讨DNA修复机制或CRISPR活性调控因子，支持常规脱靶检测，增进科研成果。

DISCOVER-Seq

DISCOVER-Seq（Disruption of Cas9 binding sites followed by sequencing）为检测CRISPR-Cas9基因编辑中的脱靶效应提供了一种创新方法。在此方法中，通过监测Cas9蛋白与DNA结合位点的变化来揭示潜在的脱靶点，能够直接在活细胞内部操作，提供真实的实验条件。

该方法的优点包括实时监控Cas9-DNA互动和较高的特异性。尽管实验设计复杂，需要特定设备和技术支持，但它被广泛应用于基础研究和临床前试验的多个领域。

体外检测方法

体外检测方法在实验室条件下，通过提取生物体成分或合成材料进行测试，能够提供细致的控制。

Digenome-seq

Digenome-seq是一种高通量测序方法，能够全面检测CRISPR-Cas9的脱靶效应。通过在体外使用纯化的基因组DNA模拟Cas9的切割作用，Digenome-seq可以精准发现脱靶位点。其优点在于无需复杂的体内实验设置，但对于仅在细胞内发生的脱靶事件可能会遗漏。

SITE-Seq

SITE-Seq被特别设计用于检测CRISPR-Cas9系统的脱靶效应，通过富集Cas9切割位点来实现检测。其在大规模sgRNA筛选方面的应用，使其在基因编辑效率和特异性评估中发挥了重要作用。然而，此方法仍可能存在随机断裂导致的背景干扰。

CIRCLE-seq和CHANGE-seq

CIRCLE-seq针对SITE-Seq的背景问题进行改进，通过环状DNA技术感染，从而降低噪音，提升数据准确性。而CHANGE-seq则进一步提高了CIRCLE-seq的成环效率，为脱靶检测提供了更高的灵敏度和准确性。

AID-seq

为解决DNA用量大和背景信号高的问题，AID-seq推出了一种超灵敏的方法，能有效降低假阳性率，使得脱靶检测更为准确。

随着技术的不断进步，生物医学领域的脱靶检测方法持续优化，尊龙凯时致力于在这一领域为用户提供高效精准的解决方案。无论是基础科学研究还是临床应用，评估并降低脱靶风险是未来的重要方向。我们期待更多高品质的脱靶检测手段的问世，从而进一步提升基因编辑技术的安全性与可靠性。

在此背景下，尊龙凯时积极打造一站式基因编辑安全性评估平台，涵盖靶点设计、脱靶检测、克隆扩增分析等多项服务，有助于确保CRISPR治疗方案的安全与有效。伴随技术的不断更新，我们期待为生物医学和基因治疗领域带来更多创新成果。